支原體PCR檢測(cè)培養(yǎng)方法檢測(cè)結(jié)果
　　
　　支原體PCR檢測(cè)直接培養(yǎng)法
　　
　　原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)及菌落生成。
　　
　　特點(diǎn)：是目前zui直接與靈敏之步驟，亦是用來評(píng)估其它偵測(cè)新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。
　　
　　缺點(diǎn)：培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(例如M.hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對(duì)照組，可能會(huì)造成污染。
　　
　　材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長(zhǎng)期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。）
　　
　　污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵，預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵之一。危機(jī)意識(shí)要貫徹實(shí)驗(yàn)的始終，否則不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚至造成無法彌補(bǔ)的損失。
　　
　　支原體PCR檢測(cè)方法與結(jié)果：
　　
　　1，將已檢測(cè)出有支原體污染的細(xì)胞以正常傳代密度鋪到6孔板中，一個(gè)孔加清除劑，作為測(cè)試孔，另一孔不加清除劑，作為陰性對(duì)照孔。兩孔之間間隔一個(gè)孔，以免互相污染。
　　
　　2，在清除支原體的過程中細(xì)胞以常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，并使細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一直處于清除劑的作用下。在加清除劑后第4、8、9、11天各取1毫升培養(yǎng)上清。每份上清與細(xì)胞已共培養(yǎng)48小時(shí)，除第9天的上清只共培養(yǎng)了24小時(shí)。
　　
　　3，將這些培養(yǎng)上清在16000g離心5分鐘，小心去除離心上清，將沉淀用無菌PBS洗三次，每次以16000g離心5分鐘。zui后獲得的沉淀用100微升純水重懸，在100℃水浴中孵育5分鐘，然后用于PCR反應(yīng)。
　　
　　4，按照支原體檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行PCR檢測(cè)操作，結(jié)果如下：
　　
　　4.1，與對(duì)照樣品共同反應(yīng)，用這種方式可以判斷是否出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。在加清除劑后第4天的樣品中仍可見到支原體陽(yáng)性條帶（約440bp），在第8、9、11天的樣品中，已看不到支原體陽(yáng)性條帶。
　　
　　4.2，不加對(duì)照樣品，檢測(cè)樣品單獨(dú)反應(yīng)，用這種方式可以提高測(cè)試靈敏度?？梢娫诘?天和第9天的樣品中，支原體陽(yáng)性條帶仍然出現(xiàn)，但是弱于第4天的樣品。在第11天的樣品中，有明顯的200bp以下的非特異的條帶，且亮度高于陽(yáng)性條帶，所以判斷此時(shí)的PCR產(chǎn)物是非特異反應(yīng)的產(chǎn)物，樣品中已沒有支原體DNA。